Agronomie 23 (2003) 489-493
DOI: 10.1051/agro:2003023

In situ hybridization of a radioactive RNA probe on resin-embedded legume root-nodule sections: a tool for observing gene expression in the rhizosphere?

Olivier Schumpp^a, Hassen Gherbi^a, Jacques Escoute^b, Hélène Payre^a and Jean-Jacques Drevon<sup>a

a</sup>  UMR Rhizosphère et Symbiose, INRA, place Pierre Viala, 34060 Montpellier Cedex 1, France
^b  CIRAD/BIOTROP UMR BDPPC, avenue d'Agropolis, 34060 Montpellier Cedex, France

(Received 14 October 2002; accepted 13 March 2003)

Abstract
In this work we performed in situ hybridization of a carbonic anhydrase RNA ³⁵S-labeled probe on nodule sections previously embedded in a methacrylate resin. The results were more precise and reproducible than those obtained on paraffin-embedded nodules. Thanks to the small thickness of the sections and the good preservation of tissue during sectioning, the specific localization of the carbonic anhydrase gene expression in the inner cortex of the nodule could be described quite precisely. It is argued that these results are consistent with the hypothesis of osmoregulation of the symbiotic nitrogen fixation. Moreover, the quality of these results with a radioactive probe makes it possible to consider using ISH for such rhizospheric applications as localizing and quantifying a microbial invasion of the endorhizosphere or the rhizoplan by using bacterial- or fungal-specific RNA probes, and counting the number of radioactive dots per cell. However, major artifacts observed with a digoxegin RNA cold probe makes it necessary to recommend the use of a radioactive RNA probe for these prospects.

Résumé
Hybridation in situ d'une sonde ARN radioactive sur des coupes de nodosités de légumineuses incluses dans une résine méthacrylique : un outil pour observer l'expression génique dans la rhizosphère ? Dans ce travail, nous avons réalisé une hybridation in situ d'une sonde ARN d'anhydrase carbonique marquée au ³⁵S, sur des coupes de nodosités préalablement incluses dans une résine méthacrylique. Grâce à la faible épaisseur des coupes et la bonne conservation des tissus durant la coupe, la localisation spécifique de l'expression du gène d'anhydrase carbonique dans le cortex interne des nodosités a pu être décrite très précisément. Il est argumenté que cette localisation est en accord avec l'hypothèse d'osmorégulation de la fixation symbiotique d'azote. De plus, la qualité de ces résultats avec une sonde radioactive suggère qu'il serait possible d'utiliser l'hybridation in situ pour des applications telles que la localisation et la quantification d'une invasion microbienne de l'endorhizosphère ou du rhizoplan en utilisant des sondes ARN spécifiques de champignons ou de bactéries, et en comptant le nombre de signaux radioactifs par cellule. Il est recommandé d'utiliser un marquage radioactif des sondes, en raison des artefacts observés dans ce travail avec une sonde ARN marquée à la digoxygénine.

Key words: common bean / microscopy / rhizobia / rhizosphere / symbiotic nitrogen fixation

Mots clés : fixation symbiotique d'azote / haricot / microscopie / rhizobia / rhizosphère

Correspondence and reprints: Jean-Jacques Drevon email: drevonjj@ensam.inra.fr

Communicated by Yves Dessaux (Gif-sur-Yvette, France)

© INRA, EDP Sciences 2003